前沿资讯丁苯酞可改善大脑中动脉闭塞后

近日，上海交通大学Med-X研究院的杨国源教授团队的最新研究成果“DL-3n-ButylphthalideImprovesBloodBrainBarrierIntegrityinRatAfterMiddleCerebralArteryOcclusion”发表在FrontiersinCellularNeuroscience杂志上（IF=3.），本研究旨在评估丁苯酞（NBP）对缺血性卒中大鼠急性期血脑屏障功能和结构完整性的影响。研究结果证明：NBP通过降低AQP4表达和MMP-9酶活性保护缺血性卒中急性期血脑屏障完整性，进而减轻脑损伤，MAPK信号通路可能与此过程有关。

研究背景

在正常大脑中，血脑屏障通过将脑组织与外周循环分开来促进脑内平衡。血脑屏障紊乱是卒中急性期的典型病理特征，不仅导致脑水肿，还允许吞噬细胞、红细胞和诱导炎症反应和神经细胞死亡的代谢产物通过，这些共同导致缺血性卒中的高死亡率。因此，靶向保护血脑屏障可能是急性缺血性卒中治疗的一种可行方法。

此前研究团队发现NBP治疗促进了缺血大鼠大脑中动脉（MCA）的扩张和微血管密度的增加。尽管对NBP在脑缺血的疗效已经有了广泛的研究，但需要更多有关于其效果和潜在机制的有力证据。特别是，NBP对血脑屏障完整性的保护作用及其潜在分子机制尚不清楚。

研究方法

本研究选用82只成年雄性SD大鼠构建tMCAO模型，随机分为NBP治疗组和安慰剂（植物油）组，每日灌胃给药，连续3d。使用激光散斑对比成像（LSCI）在5个指定的时间点缺血前、缺血10min、再灌注20min、缺血后4.5h、12h）评估脑血流量（图1A）。在tMCAO后第1天和第3天，用mNSS评分评估大鼠的神经行为结果。然后处死大鼠进行免疫组织化学分析，测量脑水肿和缺血性脑梗死体积。通过伊文斯蓝染色和紧密连接蛋白的变化来评估血脑屏障的完整性。通过WesternBlot、实时荧光PCR分析、明胶酶谱法进一步研究AQP4和eNOS表达、MMP-9酶活性以及脑缺血性卒中后NBP作用的可能信号通路。

图1实验设计示意图和用于免疫荧光分析的脑区（A）试验设计和样品采集时间表；（B）神经行为测试后收集的大脑样本，以评估血脑屏障紧密连接蛋白的缝隙形成情况；（C）用于免疫染色和分析的大脑区域

研究结果

1.NBP减轻脑水肿、增加脑血流量和改善神经行为结果

与对照组相比，NBP组大鼠纹状体区域梗死面积缩小（图2A）；对照组大鼠皮质和纹状体梗死面积均较大；在tMCAO后1d和3d，与对照组相比，NBP组脑水肿体积和脑梗死体积也减小（图2B、C）（p0.05）。同时，mNSS评分显示，NBP治疗在tMCAO后第1天和第3天均能减轻神经行为缺损（p0.01，图2D）。

图2NBP减轻tMCAO大鼠的水肿并改善神经行为结果（A）光学显微镜显示NBP治疗组和对照组在tMCAO后1d和3d的甲酚紫染色，虚线表示梗死区的边界，半定量测定tMCAO后1d和3dNBP治疗组和对照组大鼠的脑水肿体积；（B）和脑梗死体积（C）；（D）条形图显示NBP治疗组和对照组在tMCAO后1d和3d的mNSS评分

NBP治疗显著提高再灌注后脑血流量（p0.05），并持续至tMCAO后12h（p0.01）。同时，对照组再灌注后CBF变化呈下降趋势（图3A、B）。为了进一步探索导致脑血流量增加的分子机制，研究检测了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在血管舒张中的表达。结果显示，NBP治疗后4.5h和24heNOS蛋白表达明显高于对照组（图3C、D，p0.05），这可以解释NBP治疗后脑血流量增加的原因。

图3NBP可增加tMCAO后大鼠的脑血流量（CBF）（A）显微照相显示NBP治疗组和对照组动物在缺血前、MCAO后10min、再灌注10min、阻断后4.5h和12h用激光散斑对比成像仪（LSCI）测量脑血流量（CBF）；（B）条形图显示不同时间点同侧大脑半球体表脑血流量的变化

2.丁苯酞对血脑屏障完整性的保护作用

为评价血脑屏障功能的完整性，在tMCAO后4.5h、1d和3d经颈静脉注射2%伊文思蓝（EB）。NBP治疗后EB渗出仅局限于同侧大脑半球的纹状体，而对照组的纹状体和皮质均检测到EB渗出（图4A），这与甲酚紫染色结果（图2A）一致。EB定量结果显示，与对照组相比，在tMCAO后第1天和第3天NBP治疗组的大鼠EB总渗出量减少（p0.01，p0.，图4B）。为了进一步评估血脑屏障的通透性，在tMCAO后1d和3d用IgG抗体染色来评估IgG侵袭的严重程度。结果表明，NBP治疗组大鼠脑内IgG浸润主要发生在纹状体，而对照组纹状体和皮质均有IgG浸润（图4C）。半定量分析显示，NBP治疗组在tMCAO后1d和3d的IgG侵袭率均低于对照组（p0.01，p0.05，图4D）。

图4NBP可减少tMCAO后大鼠血脑屏障渗漏（A）在tMCAO后1d和3d，NBP治疗组和对照组大鼠的全脑和脑区均有伊文思蓝（EB）渗出，用分光光度计在nm（G）处记录渗出量；（B）条形图显示NBP治疗组和对照组在tMCAO后4.5h、1d和3d的EB渗出量的半定量

此外，为探讨NBP是否保护了BBB结构的完整性，采用内皮细胞标记物CD31对紧密连接蛋白ZO-1和occludin进行染色。结果显示，NBP治疗显著减弱了卒中诱导的微血管壁中ZO-1和occludin介导的缝隙形成，从而在tMCAO后第1天和第3天保持了紧密连接蛋白的结构完整性（图5A-D）。

图5NBP可减少tMCAO后大鼠血脑屏障紧密连接断裂（A）光镜显示NBP治疗组和对照组在tMCAO后第1天和第3天ZO-1（绿色）和CD31（红色）双重免疫染色，比例尺=25μm；（B）条形图显示ZO-1阳性染色间隙长度的半定量；（C）光镜显示NBP治疗组和对照组在tMCAO后1d和3dOccludin（绿色）和CD31（红色）双重免疫染色

3.丁苯酞通过降低AQP4表达和MMP-9活性保护血脑屏障的完整性

AQP4的过度表达和离子平衡的破坏导致缺血性脑损伤后的脑水肿。结果表明，NBP可下调AQP4蛋白（p0.01，p0.05，图6A-D）和mRNA水平（p0.01，图6E）的表达。NBP治疗组大鼠在tMCAO后1d和3d的Occludin表达增加，而ZO-1的表达仅在tMCAO后3d增加（图6A-D，p0.05）。

MMP-9在卒中急性期通过降解紧密连接蛋白介导血脑屏障通透性。研究发现，在tMCAO后1d和3d，NBP治疗组大鼠MMP-9在mRNA水平较对照组降低（p0.05，图6F）。其次，在tMCAO后1d和3d分别对NBP治疗组和对照组进行明胶酶谱检测，以评估MMP-9酶活性。结果显示，tMCAO后3d，NBP治疗组大鼠脑组织MMP-9活性明显低于对照组（p0.01，图7A、B）。

图6NBP可减少tMCAO后AQP4的表达和紧密连接蛋白的丢失显微照片显示NBP治疗组和对照组在tMCAO后1d（A）和3d（B）AQP4、ZO-1和Occludin的Westernblot表达，条形图显示NBP治疗组和对照组大鼠在tMCAO后1d（C）和3d（D）AQP4、ZO-1和Occludin表达的半定量，以及NBP治疗组和对照组大鼠的AQP4（E）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）（F）mRNA相对表达的半定量

4.MAPK信号通路参与丁苯酞对短暂性大脑中动脉闭塞的保护作用

为了进一步探讨NBP保护tMCAO后血脑屏障完整性的信号通路，研究检测了MAPK信号通路。结果显示，在tMCAO后3d，NBP治疗组大鼠MAP激酶磷酸化水平较对照组降低（图7C、D，p0.05）。PD+NBP治疗组在tMCAO后抑制MAPK磷酸化，并减弱NBP对MAPK磷酸化的影响（图7E、F，p0.05）。

图7NBP降低tMCAO后MMP-9酶活性，增加MAP激酶磷酸化水平（A）NBP治疗组和对照组大鼠在tMCAO后第1d和第3d的酶谱；（B）条形图显示活动性MMP-9水平的半定量，数据为平均值±SD；每组n=4；p0.01；NBP治疗组与对照组比较；（C）NBP治疗组、对照组和假手术组大鼠MAP激酶磷酸化的Westernblot结果；（D）条形图显示tMCAO后3d磷酸化MAPK的半定量；（E）假手术组、对照组和PD+NBP治疗组大鼠MAP激酶磷酸化的Westernblot结果；（F）条形图显示tMCAO后3d磷酸化蛋白激酶的半定量

研究结论

NBP可以减轻缺血诱导的脑水肿和神经元凋亡，促进神经功能的恢复，抑制AQP4在缺血脑中的表达，减少紧密连接蛋白的丢失，并抑制了MMP-9的表达和酶活性，这可能是通过与血脑屏障破坏相关的MAPK信号通路来实现的。该研究结果为NBP保护脑水肿受损的血脑屏障完整性提供了实验证据，提示NBP可用于脑缺血或其他脑疾病引起的血脑屏障破坏。

图8NBP在tMCAO中的疗效观察

来源

医脉通神经科

排版

乔婷婷

审校

丁慧鑫

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