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蓝耳病免疫猪繁殖与呼吸综合征病原及免
摘要：猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种猪群传染病。本文作者就该病的病原及免疫学研究情况做以阐述，以便于广大基层科技工作者能够对该病近年来在病原学及流行病学研究方面有一定的了解，为今后科学防治本病奠定基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征，病原，免疫学，综述猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）所引起的一种以猪群繁殖障碍和各种年龄阶段的猪呼吸系统症状为主要特征的一种接触性传染病[1-3，11]，主要危害养猪生产，是目前危害全球养猪生产的主要疫病之一。近年来，对国内外养猪业造成了重大损失，严重地危害着养猪业的健康发展。发病猪不分年龄大小，均可引起发病，甚至死亡。仔猪发病率在％，死亡率在50％以上，母猪早产、流产、死胎率等繁殖障碍可达30％以上，早产、流产母猪以顽固性子宫内膜炎难孕而淘汰[4，5，,5,12-14,16,18]。该病毒可直接损坏猪的免疫系统，导致猪的免疫功能下降，易继发猪瘟、伪狂犬、附红细胞体病、链球菌病、猪巴氏杆菌病、猪传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病、沙门氏菌病等其他疾病。在发生猪蓝耳病的猪场，猪瘟、伪狂犬、猪传染性胸膜肺炎免疫抗体异常低下。本病以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎）及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已经成为我国规模化猪场的主要疫病之一[6-9,18,19]。
1、病原80年代末至90年代初，该病曾席卷北美洲和欧洲，造成仔猪大量死亡和母猪流产及其繁殖力下降，经济损失十分惨重。郭宝清等（）首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），从而证实了本病在我国的存在[10，11，14，18]。1.1主要特征1.1.1猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒为有囊膜的单股正链RNA病毒，属尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，同属的还有马动脉炎病毒（EAV）、小鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）和猴出血热病毒（SHFV）等[11-13,15]。电子显微镜下观察，病毒粒子呈球形，24面体对称，核衣壳直径40～50nm，衣壳上有长约5nm的短突起，病毒离子直径约为45～55nm，核衣壳有脂质包膜包被，因而对氯仿等脂溶剂敏感，在氯化铯梯度中浮密度为1.19g/㎝3,在蔗糖中浮密度为1.18-1.23g/㎝3。本病毒不凝集哺乳动物（牛、猪、绵羊、山羊、猪、兔等）、禽类（鸡、鸭等）、啮齿类（老鼠、小白鼠、豚鼠等）和人O型红细胞，因此，不能用血凝和血凝抑制试验来诊断本病。该病毒有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。病毒在猪肺巨噬细胞内生长迅速并且出现细胞病变效应（CPE），而在其它细胞中难以生长。Collins等（）报道，有的毒株（如ATCC-VR-株）也可在CL-等传代细胞生长并产生CPE。Terpstra等（）报道本病毒在37℃、48h或56℃、45min条件下即可使病毒灭活而丧失致病力，但在低温下稳定，在－70℃条件下，病毒保存4个月以上，其感染滴度不受影响。本病毒对氯仿、乙醚敏感，对温热和外界环境理化因素的抵抗力不强。当PH小于5或大于7时，病毒的感染滴度降低90％，在血浆中存活不超过5天。但在发病猪场的环境、用具及建筑物上的病毒，在3周内仍具有感染力[13，15，16,19,20]。病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，在中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强[5,6]。1.1.2分类地位中该病毒与冠状病毒、披盖病毒均有类似之处，但通过对其基因组大小、结构、ORF同源性、转录战略、细胞亲嗜性及形态学比较的研究，显示PRRSV与动脉炎病毒关系密切，可能源于共同祖先。进一步研究氨基同一性，推测PRRSV可能是乳酸脱氢酶升高病毒（LDV）的一个变种，在环境压力等影响下进化为适应新宿主的独立种类。国际病毒分类委员会(ICTV)第六分类报告将PRRSV列入动脉炎病毒属，并从披膜病毒科中单列出来[18-23]。1.2基因与病毒蛋白1.2.1PRRSV的毒株序列已经测定，其基因组含有7个ORF，推测ORFla和ORFlb的编码病毒RNA聚合酶，ORF2～ORF7编码病毒相关蛋白，ORF7编码核衣壳蛋白。其中ORFla～ORFlb占据基因组的80％，其氨基酸序列含EAV和LDV的保守序列[23,24]。1.2.2在LAF－klop株病毒培养物中至少可鉴定出5种特异性病毒蛋白，分子量分别为15kd、19kd、24.5kd、29kd和42kd。24.5kd糖基化蛋白(E)由ORF5编码，19KD非糖基化蛋白（M）由ORF6编码，15kd核衣壳蛋白（N）由ORF7编码，并可引起强烈的免疫应答。有学者推测，42kd是E蛋白的同源或异源二聚体形式，而29kd是N蛋白的二聚体形式。尚不知ORF2与ORF4的编码蛋白是否为结构蛋白，他们未曾在病毒子中鉴定出。Kwang等（）曾克隆与表达ORF4,发现仅65％PRRS阳性血清和它们的重组蛋白反应。单一的ORF3产物为特异的Mab和纯化病毒制剂的反应性研究，认为核蛋白是病毒的一部分，但对其局部解剖学尚不清楚[24,26]。1.3不同毒株的抗原性差异病毒的基因组结构PRRSV为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组长约15kb，含有8个开放阅读框架（ORFS）[27,28]，病毒基因组的每个读码框都和相邻的读码框有部分重叠。在两种血清学毒株中5’端非编码区同源性高达99％，其中位于基因组5’端的ORF1包括ORF1a和ORF1b。ORF1编码的复制酶由病毒基因组RNA表达。虽然病毒的转录本（mRNA）较大，包含不止一个ORF,但是每个转录本中只有靠近5’端的第一个ORF才可翻译出蛋白。病毒的结构蛋白均含有糖基化位点及C端和N端疏水序列，可能分别作为信号肽和膜锚定蛋白[29,-31]。PRRSV的不同分离株之间的抗原性不同，尤其在北美分离株和欧洲分离株之间的差异更是明显。所有美洲株都相近似，病毒间有良好的交差保护作用，如Quebec株和美国ATC株之间有90％的同源性。但欧洲株Lelystad病毒与美国ATC株之间仅有50%～70％的同源性。美洲株和欧洲株之间没有完全的交叉保护，就是同种毒株的不同分离株之间也存在不同程度的抗原性差异[32，33，34]。这对于建立精确的诊断方法和研制有效的疫苗已构成很大的障碍。PRRSV基因组存在高度的变异性，通过氨基酸序列比较发现，PRRSV更接近于LDV。根据病毒基因组的差异，PRRSV可分为两个基因型：欧洲型（LV株为代表株）和美洲型（ATCC-VR-株为代表株）[35-37]。两种毒株间的氨基酸的同源性为78%～81％。我国的分离株，应用多价血清和单克隆抗体检测，证明近似于美洲型[37，38]。R.Magar等用PRRSV的15kd核衣壳蛋白Mab对北美和欧洲分离株核衣壳蛋白进行比较，发现SDOW17株Mab与加拿大分离株、美国分离株和欧洲Lelystad分离株均产生反应，但反应的滴度不同；VO17株Mab对加拿大株和美国株反应结果相同，却不与Lelystad株反应；EP也不与Lelystad株反应，而与所有加拿大分离株和美国分离株反应，但反应滴度比VO17株Mab低。可见，加拿大分离株和美国分离株反应模式相似，而与欧洲Lelystad株有较大差别。H.Mardassi等曾对魁北克参考株ORF3～7进行分子分析，也得出了一致的结果，他们发现魁北克株与Lelystad病毒之间出现了广泛的基因组变异，这是由于大量的碱基置换和增删引起的。而魁北克株与美国毒株的基因组关系较为密切。Kyoung-JinYoom等用SDOW17、VO17、M、EP和M等5种15kd核衣壳蛋白Mab均起反应，有3个毒株不能与EP株Mab反应而源于宾夕法尼亚州的PA－1分离株只能被VO17株Mab识别。由此说明，即使在不同的美国分离株之间也有抗原性的差异。研究结果表明，PRRSV可分为2个亚群，即欧洲亚群和美国亚群，而在诊断PRRS时，虽然曾有学者认为SDOW17可与所有欧洲和北美分离株产生反应，但现在看来，使用某一种单抗显然是不够的，而应该有几种不同的单抗进行综合诊断[36-38]。1.4PRRSV与继发性病原的相关性感染PRRSV的猪群经常继发感染细菌性及支原体性疾病（如沙门氏菌病、放线杆菌病、巴氏杆菌病以及支原体肺炎等），因此，蔡宝祥等认为，对继发性病原的研究是不可忽视的。Galina等（）研究显示PRRSV与Ⅱ型猪链球菌共同接种SPF猪时，使临床症状加重，细菌滴度增高，证明PRRSV可作为SPF猪感染强毒株猪链球菌的诱因。Lo’pez等从一些有支气管肺炎症状的PRRS病猪肺中发现有卡氏肺孢子虫。Wensvoot等发现，被PRRSV与胸膜肺炎放线杆菌合并感染的猪肺部病变明显。O.Kamogawa等从患有PRRS病猪中分离出猪呼吸道冠状病毒（PRCV）。Groschup等认为：PRRSV的感染使肺中巨噬细胞数目减少，结果使呼吸系统病原容易侵入，加速了肺炎的感染。Wensvoot等认为PRRS病猪的呼吸系统症状是不能完全归因于PRRSV的[38,44]。但是，Cooper等（）的研究却发现PRRSV与细菌混合接种，临床症状和病理变化没有区别。W.G.VanAlastine等（）研究了PRRSV的感染是否会提高幼猪实验性肺炎支原体感染的严重性，发现PRRSV感染对实验性的急性支原体肺炎的严重性没有影响，对于肺炎支原体的体液免疫反应也未见显著影响，从而认为猪支原体肺炎不因预先被PRRSV感染而发生重大改变。这些相互矛盾的试验结果是否与所选的毒株本身、试验动物、感染方法、检验方法等方面有关，尚需进一步研究[39，40]。自PRRS首次发现以来，已有十多年，但对该病仍无有效对策，PRRS继续在世界范围内呈蔓延之势。因此，有必要对PRRSV作进一步研究，包括它的起源、进化、基因结构功能与表达、蛋白结构与功能及变异机制，与其它相关病原相关性等方面，从而有助于人们最终实现对该病的控制。
2、免疫学研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）对猪免疫系统功能的影响主要包括以下几个方面：2.1对免疫细胞的影响PRRSV感染早期及康复阶段，感染猪的淋巴细胞亚群发生异常变化，CD2+和CD8+细胞数量增多，C4+/CD8+细胞比例下降。CD8+亚群主要参与细胞毒作用（CTL），因此CD8+细胞的增殖对于清除病毒感染的靶细胞有重要作用（Nielsen,）,在感染PRRSV前后胸腺内细胞亚群并无变化，说明PRRSV不影响胸腺细胞的分化[41，42]。PRRSV感染猪后主要破坏猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和肺内皮细胞巨噬细胞（PIMs）。猪在感染PRRSV后，其数量由占正常细胞的95％下降到50％，但感染后27天肺泡内巨噬细胞的数量可回升到80％。有报道猪感染PRRSV后，其单核细胞、生殖细胞也发生凋亡（Sur,etal.）。PRRSV对免疫细胞的影响，被认为是细胞凋亡所引起（Poland,）。后来证明PRRSV的GP5蛋白可诱导细胞的凋亡。其特征为细胞收缩、染色体收缩、DNA断裂等，最终导致细胞的死亡（Surez.）。PRRSV还可导致旁观细胞的凋亡（Sirnarumitr.）。张晓梅等（）用美洲株（ATCCVR-）和分离株实验感染SPF猪均能引起外周血液单核细胞和肺泡巨噬细胞凋亡。PRRSV诱发的细胞凋亡并不是直接由病毒引起的，而是通过一种间接机制诱发的[28，30，39]。2.2体液免疫体液免疫所产生的抗体主要是针对PRRSV的结构蛋白：M、N、GP5。在感染后7天，可检测到特异性抗体IgM，其滴度在14～21天达到高峰，然后迅速下降。IgG则在21～28天达到高峰，并维持6～9周不变。在感染的早期可产生较高水平的非中和性抗体。而PRRSV的中和性抗体要在感染后1～2个月才能检测，而且产生非常缓慢。试验表明，PRRSV的特异性循环抗体可持续至少一年[36，37]。运用Westernblot技术证实，猪接种PRRSV7天后可检出N蛋白的特异性抗体，接种9～35天后可检出针对M蛋白和E蛋白的抗体。但Loemba等认为E蛋白的抗体比其他病毒蛋白的抗体产生要早。目前证明N蛋白对病毒没有中和作用，但已证明GP4和GP5的单抗对PRRSV具有中和作用（Weiland,等）。而且，GP5单抗的中和作用比GP4单抗要高。应用杆状病毒表达ORF3所编码的蛋白（GP3）进行免疫实验，表明GP3在PRRS的保护性免疫中也起重要作用[39，40]。2.3细胞免疫细胞介导的免疫反应在对抗PRRSV感染的过程中起着重要作用。Rossow等（）报道，猪在感染PRRSV后28天有抗原特异性的淋巴细胞增生，在第49天达到高峰，第77天开始下降。这种淋巴细胞增生性反应可被CD4＋及MHG-II类抗原的抗体所阻断，表明这种增生反应是依赖于CD4+及T淋巴细胞的。PRRSV感染猪体后还可刺激辅助性T细胞（TH）和杀伤性T细胞（Tc）产生[40,42,]。PRRSV的GP2-5、M、N蛋白都能刺激T淋巴细胞的增生。但是，N蛋白的作用最差，M蛋白的作用最强。各种蛋白的诱导作用和该蛋白的浓度呈正相关。这表明M蛋白在细胞免疫中居主要地位。另外，PRRSV感染还能诱使猪体产生迟发型变态反应（DTH）。2.4细胞因子的产生猪感染PRRSV后有多种单核细胞因子释放[41，42]，主要有IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a、IFN-a、IFN-β等因子。这些因子有的能抑制病毒的复制，如IFN因子；有的同体温调节有关，如IL-1可直接作用于体温调解中枢引起猪发热；IL-6、IL-8则参与B细胞和T细胞的分化与成熟。Bautista最近报道，淋巴细胞所产生的IFNγ因子可抑制PRRSV在巨噬细胞中的复制，其作用机制是它能阻断病毒蛋白的正常合成，另外它还能增强巨噬细胞产生超氧负离子的能力。因此，IFNγ在对抗PRRSV的感染中起着重要作用[25,27，39]。在肺泡巨噬细胞的培育物上加入PRRSV抗体后，可使病毒的复制增强，同样在病毒中加入PRRSV抗体后其在妊娠中期胎儿体内的复制也大为增强，这种现象称为抗体依赖性增强作用[26,27，41，42]（Antibodydependentenhoncemenct,ADE）。其原因可能是病毒与抗体形成免疫复合物后借助细胞表面的FC受体与PAM结合，从而促进了病毒进入细胞。ADM在PRRS的发病机制及免疫学上具有重要意义，通过母源抗体获得被动免疫的仔猪，一旦母源抗体水平下降至保护水平以下，PRRSV就会表现ADE，从而增加了仔猪的易感性。ADE还会给疫苗的研制带来困难，因为疫苗毒诱导的抗体可能会增强野毒株在猪体内的复制，而野毒株产生的抗体也可能会增强疫苗毒的复制。
参考文献：略。
作者简介：张明林（—），男，兽医师，兽医硕士学位，主要研究方向：规模化猪场疫病防控、免疫技术及猪人工授精技术的基层应用。
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